Способы очистки белков и определение кинетики ферментативной реакции

При диализе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка) , диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических белков. Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.

Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекулярных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтрации. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или других в-в.

Кинетика ферментативной реакции

-т. е зависимость скорости реакции от ее условий, определяется в первую очередь свойствами катализатора.

Модель Михаэлиса-Ментена.

Исходит из того, что вначале субстрат А образует с ферментомЕ комплекс, который превращается в продукт В, намного быстрее, чем в отсутствии фермента.

Константа скорости каталитической реакции соответствует числу молекул субстрата, превратившихся в продукт одной молекулой фермента за 1 сек.

Активность фермента:

[ЕА]/[Е]t=[А]+Км[А],

где[Е]t-общая концентрация фермента

V=Ккат. [ЕА]

V=Ккат. *[Е]t*[А]/Км+[А], [М/с]

-уравнение Мехаэлиса-Ментена.

Уравнение содержит два параметра, которые не зависят от концентрации субстрата[А], но характеризуют свойства фермента.

1) Vмах. =Ккат. *[Е]t-

характеризует эффективность катализа

2) Км-константа Михаэлиса

Км=[А] при V=Vмах/2 Км=[Е]*[А]/ [ЕА],

характеризует сродство фермента к субстрату.

Высокое сродство к субстрату характеризуется низкой величиной Км и наоборот.

Все это осуществляется при определенных условиях (допущениях) :

-необратимое превращение ЕА в Е+В

-достижение равновесия м/д Е, А и ЕА

-отсутствие в растроре других форм фермента, кроме ЕА и Е